포자 외에도 엑소스포리움 설탕 탄저병은 시스 및 트랜스의 식물성 탄저균 유전자 조절에 영향을 미칩니다

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 5060(2023) 이 기사 인용

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Bacillus anthracis exosporium nap은 환경 및 숙주 시스템과 상호 작용하는 포자의 가장 바깥 부분입니다. 이 층의 변화는 광범위한 생리학적, 면역학적 과정에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 독특한 설탕인 안트로스는 일반적으로 엑소스포리움 낮잠의 가장 먼 지점을 코팅합니다. 우리는 이전에 B. anthracis anthrose를 음성으로 만드는 추가 메커니즘을 확인했습니다. 이 연구에서는 몇 가지 새로운 ant-B. anthracis 균주가 확인되고 포자 생리학에 대한 안트로스 음성의 영향이 조사됩니다. 우리는 생약독화 Sterne 백신과 배양 여과액 탄저병 백신이 포자의 비단백질 성분을 표적으로 하는 항체를 생성한다는 것을 입증합니다. 영양 B. anthracis Sterne 신호 전달 분자로서 안트로스의 역할은 발광 발현 균주 분석, RNA-seq 실험 및 웨스턴 블롯에 의한 독소 분비 분석에 의해 암시됩니다. 순수 안트로스와 포자형성을 유도하는 뉴클레오시드 유사체 데코이닌은 독소 발현에 유사한 효과를 나타냈습니다. 공동 배양 실험에서는 B. anthracis의 유전자 발현 변화가 세포외 상호작용(trans)의 안트로스 상태 외에도 세포내 안트로스 상태(cis)에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 독특한 포자 특이적 당 잔류물이 탄저병의 생태, 병인 및 백신학에 영향을 미치면서 영양 B. 탄저균의 생리학, 발현 및 유전학에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 메커니즘을 제공합니다.

탄저균 Bacillus anthracis는 탄저병을 일으키며 포자를 형성하여 가혹한 환경 조건에서 살아남을 수 있습니다1. 내생포자를 둘러싸고 있는 것은 엑소스포륨이라고 불리는 탄수화물이 풍부한 느슨한 단백질 층입니다2. 포자형성 동안, 엑조스포리움은 CotE, CotO 및 CotY 단백질의 조화로운 노력을 통해 모세포에서 형성되는 동안 조공 주위에 조립됩니다3. 엑소스포리움의 바깥쪽을 향한 부분은 엑소스포리움 냅으로 알려진 벨크로 같은 층을 생성하는 당단백질로 구성됩니다. 낮잠에는 기저층 단백질 ExsFA/BxpB 및 ExsFB4,5에 부착된 글리코실화된 BclA 및 BclB 단백질의 돌출된 줄기가 포함되어 있습니다. 당단백질 exosporium nap은 포자에 하전된 표면을 부여하고 정지 포자와 토양 입자, 동물 숙주 세포 및 기타 포자를 포함한 외부 환경 사이의 상호 작용을 중재하는 원위 표면입니다. 발아 시 엑소스포리움 낮잠이 사라지고 B. anthracis가 발아하기 시작한 다음 탄저균 독소를 분비하면서 영양 형태로 복제됩니다6.

영양 세포 단백질을 제거하기 위해 세척된 엑소스포리아로부터 제조될 때 8개의 단백질이 엑소스포리움의 중요한 구성 요소로 확인되었습니다7. BclA 단백질은 엑소스포리움의 주요 단백질 성분이며 엑소스포리움 표면에서 튀어나온 줄기 모양의 낮잠 섬유를 형성합니다. BclA의 콜라겐 유사 반복 영역은 bclA 유전자 크기에 따라 B. anthracis 계통 간에 길이가 다릅니다. 이러한 다형성은 포자 표면에서 관찰 가능한 낮잠 두께 변화에 기여합니다8. BclA는 콜라겐 유사 영역이 GalNAc-Rha-Rha-Rha-Ant9의 5당류 반복으로 조밀하게 글리코실화된 삼량체 형태로 존재합니다. 개미는 단당류인 안트로스이며 자연에서 거의 발견되지 않는 희귀한 설탕입니다. 안트로스 생합성 오페론은 잘 특성화되어 있으며 antA, antB, antC 및 antD의 4개 유전자로 구성되어 있습니다10,11. 모든 유전자는 antA의 녹아웃으로 측정 가능한 포자 안트로스를 절반으로 감소시키고 antB, antC 또는 antD의 녹아웃으로 검출 가능한 포자 안트로스 수준을 없애는 안트로스 생합성에 관여합니다11. 안트로스는 다른 Bacillus 종에 의해 합성되지 않습니다. B. 탄저병 포자의 표면에도 독특하게 존재합니다. 대체 설탕 잔류물은 Bacillus cereus 포자에 존재하는 세레오스와 같은 다른 Bacillus 종의 포자에서 발견됩니다12,13. BclA가 엑소스포리움 표면에 존재하더라도 발병에 대한 기여는 불분명합니다. BclA는 고용량 Sterne4 또는 Ames14 마우스 챌린지 실험에서 완전한 병독성을 위해 필요하지 않았지만, 다른 연구에서는 ΔbclA Sterne 34F2 돌연변이가 야생형 Sterne 34F215에 비해 LD50이 50-70% 감소했습니다. 고용량 연구 설계는 보다 민감한 LD50 연구에서 밝혀질 수 있는 전격성 독소 및 캡슐 생산으로 bclA 녹아웃의 병독성 효과를 가릴 수 있습니다. 중요한 것은 BclA 녹아웃이 포자 표면에서 안트로스를 효과적으로 제거하는 동시에 영양 세포에서의 생합성을 그대로 유지한다는 것입니다. BclA를 제거하면 상피 세포, 섬유아세포 및 내피 세포와의 연관성이 증가하지만 대식세포에서는 증가하지 않는 것으로 나타났습니다16. 이는 BclA 녹아웃 포자가 대식세포 수용체 CD14에 결합할 수 없는 반면 antC/degT 녹아웃 포자에서 BclA로부터 탄저병을 제거하면 람노스 잔기가 드러남으로써 CD14 수용체에 대한 결합이 증가한다는 것을 보여주는 다른 사람들에 의해 확증되었습니다. 이는 bclA 돌연변이 포자로 공격받은 쥐가 에어로졸 공격 후 기관지폐포 폐액에 더 많은 포자를 보유한다는 사실과 일치합니다. 안트로스의 정확한 기능과 발병에 대한 기여는 불분명한 상태로 남아 있으며, 토양 환경 및 면역체계 세포와의 상호작용을 뒷받침하는 증거도 있습니다. 이전에 우리는 이종 B. 탄저병 Sterne 모델에서 포자 표면에서 탄저병을 제거하면 발아 효율이 감소하고 포자 형성 속도가 증가한다는 것을 발견했습니다. 생리학적 변화 외에도, 안드로스 음성 포자는 피하 마우스 챌린지 모델에서 LD50의 절반을 나타내어 사망에 이르는 시간이 더 빨라지고 숙주 기관에서 더 빠른 전파가 이루어졌습니다. Galleria mellonella 유충에 포자를 투여한 두 번째 동물 모델에서도 치사율 증가가 관찰되었습니다18.

150 kDa on an SDS-PAGE gel because of its numerous polysaccharide modifications. A downward shift is evident when blotting spores lacking anthrose (ΔantC). Blotting of the same spore preparations with pooled anthrax vaccine adsorbed (AVA)-vaccinated human serum show the human serum has moderately less binding to ΔantC spores compared to WT in the high-molecular weight region of BclA region while having increased binding in the lower molecular weight BclA and PA region (Fig. 2F). To further investigate the reactivity of vaccine serum to non-protein bacterial components in vegetative bacteria and spores, protein was degraded with proteinase-K then blotted with rabbit anti-B. anthracis polyclonal antibody, pooled human AVA plasma, Sterne-vaccinated bison serum, and naïve bison serum (Fig. S2A–E). Naïve bison serum was unreactive to all samples run on the gel (Fig. S2D). The immune serum samples reacted strongly with untreated vegetative cells (lanes 1) coinciding to a protein migrating at ~ 83 kDa; the same as PA (Fig. S2B–D). Vegetative cell lysates treated with proteinase-K to degrade proteins (lane 2) showed little reactivity with the immune serums. Lane 3 of each blot are spore lysates. Immune samples appear to react with PA from spore lysates. PA can bind to the outside of spores22. High molecular weight bands specific to spores are present. When the proteins are degraded by proteinase K treatment, a high molecular weight material continues to react with each immune sample. This high molecular weight material that is proteinase-K resistant coincides with heavily glycosylated BclA protein specific to the spore. The Sterne vaccine is a live attenuated spore vaccine, so it is not surprising the bison serum sample reacted strongly to spore specific non-protein antigen (Fig. S2D). The AVA vaccine is produced from precipitated culture filtrate from a vegetative non-encapsulated B. anthracis Sterne strain (as is the anthrax vaccine precipitated (AVP) vaccine); similar strains are the live-attenuated spores used in the veterinary vaccine23. The B. anthracis strain used for AVA production is V770-NP1-R24. This strain is grown anaerobically in a fermenter and culture filtrate is adsorbed to alhydrogel. B. anthracis V770-NP1-R is a non-proteolytic pXO2-negative derivative of strain V7701 that was isolated from a bovine anthrax case in Florida in 195125. The blots show reactivity to non-protein spore-specific material, indicating a small amount of spore specific antigen is present in AVA (Fig. S2E). An analysis of the similarly produced AVP vaccine from the UK did observe spores in vaccine production vessels, however the investigators concluded with a dearth of supporting data that this was due to failure of 30% of the inoculum to germinate26. Proteomic analyses of the AVP vaccine found the major components to be PA (64%), LF (8%), and EF (3%) and 258 other proteins making up the other 25%, non-protein components were not analyzed27. BclA is the immunodominant protein on the spore and its change or modification, such as anthrose removal, could modify immunoreactivity in human and animal hosts./p>